Cromatografía en columna
La cromatografía en columna es quizás el método más general, utilizado para la separación, a la vez que para la purificación, de diferentes compuestos orgánicos que se encuentren en estado sólido o líquido.
En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria utilizada, es decir, el absorbente, se coloca en el interior de una columna de vidrio, la cual finaliza con una llave para controlar el paso de sustancias al exterior de la columna. La fase estacionaria se impregna con el eluyente o fase móvil. Seguidamente la mezcla orgánica que nos interesa separar la depositamos por la parte superior de la fase estacionaria, y así la fase móvil podrá ir atravesando el sistema.
Los compuestos que se encuentran disueltos en la fase móvil, poco a poco saldrán de la columna cromatográfica, y se recogen en fracciones. Las fracciones menos polares, que son por lo general las que se retienen poco o nada en el absorbente, serán las primeras en salir de la columna. En cambio, las sustancias más polares, quedan retenidas por más tiempo en el absorbente, y a menudo es necesario el uso de diferentes disolventes con la finalidad de incrementar su polaridad para que sean arrastradas por estos.
El tiempo que se necesita para hacer fluir un compuesto por la columna, se conoce con el nombre de tiempo de retención. Este tiempo varía, siendo característico de cada compuesto en una condiciones cromatográficas determinadas, que varían según el absorbente usado, el disolvente, la presión, el diámetro que tenga la columna utilizada, etc.
El absorbente mayormente utilizado para las cromatografías en columna, es el gel de sílice. A veces, en sustitución del gel de sílice, cuando éste es incompatible con la mezcla a cromatografiar, se utilizan la alúmina o el florisil (silicato magnésico). La cromatografía en columna puede realizarse por gravedad o a media presión. Cuando se realiza a media presión, se conecta la cabeza de la columna a un compresor o a una línea de aire comprimido.
La medida de las partículas de gel de sílice para realizar las cromatografías a media presión debe ser más pequeñas que en el caso de la cromatografía por gravedad. Si en la cromatografía por gravedad utilizásemos un gel de sílice con un tamaño de partículas más pequeñas, no se produciría elución, pues se impediría el flujo del disolvente. Pero en cambio, si aplicamos presión, entonces debido a la fuerza si se produciría la elución por el disolvente.
A causa de la disminución del tamaño de las partículas del absorbente, se produce una separación más eficaz. Generalmente la cromatografía a media presión, produce mejores resultados que la cromatografía por gravedad, y además, al ser más rápida, es la más utilizada.
Cuando vamos a realizar una cromatografía en columna, lo primero que debemos hacer es elegir un disolvente adaptado para nuestro caso, para así optimizar la separación de los componentes de la mezcla. Dicha operación se produce a través de cromatografía analítica en capa fina. La variante más influyente en la eficacia de la separación de la cromatografía a media presión usando gel de sílice es el diámetro de la columna, así como la cantidad de gel utilizado.
Para elegir el disolvente, primero se lleva a cabo una cromatografía en capa fina de la muestra a analizar. El disolvente debe producir una buena separación de los componentes de la mezcla en la placa, colocando el componente menos polar a un Rf cercano a 0.3. En el caso de columnas pequeñas, lo ideal es usar un eluyente menos polar que el conseguido en el resultado de la cromatografía en placa.
A veces se utilizan mezclas de disolventes y se hace una elución en gradiente. Para esto, la cromatografía se inicia con una mezcla de disolventes de polaridad adecuada para poder separar el componente que posea mayor Rf, y así, una vez recogido, se aumentará poco a poco la polaridad para poder ir separando los componentes más polares. Si cuando se empieza la cromatografía se usa un disolvente excesivamente polar, los componentes de la mezcla eluirán conjuntamente, lo que llevaría a que la separación no tenga lugar. Una de las mezclas de disolventes más utilizadas es hexano/acetato de etilo.
