Cromatografía en capa fina
En la cromatografía analítica en capa fina, la fase estacionaria o también llamada, absorbente, se encuentra colocada uniformemente, formando una finísima capa de un espesor en torno a 0.1 mm, sobre un soporte o placa de vidrio o metal. La mezcla que deseamos analizar se colocará a una corta distancia del borde inferior de la mencionada placa, la cual introduciremos en una cubeta o recipiente que contendrá la fase móvil, o también llamado, eluyente. La fase móvil irá ascendiendo poco a poco sobre la placa de la fase estacionaria a través de capilaridad, desplazando a los diferentes componentes de la mezcla a analizar, a distintas velocidades, lo que provocará la separación de la mezcla. Cuando el frente del disolvente se sitúe próximo a la parte superior de la placa, sacaremos la placa de la cubeta con la finalidad de dejarla secar para poder ver las manchas de los diferentes componentes.
La relación de las distancias recorridas por el compuesto y por el disolvente, desde el punto de origen del cromatograma, se conoce como Rf (rate factor), el cual posee un valor constante para cada compuesto en condiciones determinadas. Estas condiciones pueden ser el tipo de absorbente utilizado, el tamaño de la cubeta, la temperatura, el disolvente, etc. Es poco factible reproducir exactamente las condiciones experimentales, así que se suele comparar una muestra con otra, eluyendo ambas dentro de la misma placa. Así, para poder calcular el Rf, se sigue la siguiente fórmula:
Rf = Distancia recorrida por el compuesto / Distancia recorrida por el disolvente
La distancia que recorre el compuesto se suele medir desde el centro de la mancha, por lo cual se suelen hacer unas marcas en la placa, si dichas manchas son extremadamente grandes, el valor del Rf será erróneo. Así realizamos unas marcas en la placa donde depositaremos con ayuda de una pipeta un mínimo de muestra.
Cuanto más polar sea el compuesto, más retenido estará en el absorbente, y por tanto irá más lento y el Rf será también menor. Por otra parte, los compuestos poco polares, se consiguen desplazar a más distancia desde el origen. La polaridad del disolvente influye en el valor del Rf, por lo que deberemos tenerlo en cuenta. Así, para un mismo tipo de compuesto, un aumento de la polaridad del disolvente hará aumentar su desplazamiento en la placa y por lo tanto también aumentará su Rf.
Para elegir un eluyente, se recomienda elegir un disolvente en el que los componentes que formen la mezcla presenten un Rf de entorno a un 0.3 ó un 0.5. Para encontrar el eluyente ideal, es necesario probar con diferentes disolventes con distintas polaridades o con mezclas de varios de ellos. En estos casos, debemos cambiar a disolventes más o menos polares.
En el caso de compuestos poco polares, los cuales se desplazan del origen con bastante facilidad, se utiliza un disolvente apolar, generalmente el hexano. Cuando se trata de compuestos con una polaridad media, es aconsejable usar mezclas de hexano/ acetato de etilo en diferentes proporciones según la polaridad. Los productos más polares de todos, los cuales quedan muy retenidos en el absorbente, necesitan un disolvente más polar como pueden ser el metanol o distintas mezclas de cloruro de metileno/metanol en diferentes proporciones.
Una vez realizada la cromatografía, pasamos a su visualización. La gran parte de las placas cromatográficas contienen un producto indicador fluorescente que permite la visualización de los compuestos que son activos a la luz ultravioleta, concretamente a 254 nm. El indicador absorbe la luz UV, y emite luz visible, por lo general de color verde. La presencia de un compuesto activo que se encuentra en el UV evita que dicho indicador absorba luz en la parte en la cual hemos colocado el producto, lo cual se traduce en ver una mancha en la placa lo que nos indica la presencia de un determinado compuesto.
Cuando se trata de compuestos que no consiguen absorber la luz UV, la visualización del cromatograma necesita usar un agente revelador. Dicho revelador debe reaccionar con los productos que son absorbidos dando compuestos de colores. Por lo cual, el revelador a usar depende del tipo de compuesto que queramos visualizar.
